Các cơ chế phân tách trong HPLC

Có ba cơ chế phân tách chính trong HPLC. Đó là dựa vào:

• Độ phân cực
• Điện tích
• Kích thước phân tử

Tách dựa trên độ phân cực

Cấu trúc phân tử, hoạt tính và các tính chất lý hóa được quyết định bởi sự sắp xếp các nguyên tử và liên kết giữa chúng. Trong một phân tử, sự sắp xếp cụ thể các nguyên tử quyết định tính chất riêng biệt của chúng và các phản ứng hóa học có thể dự đoán trước gọi là nhóm chức. Cấu trúc sẽ quyết định xem chất đó phân cực hay không phân cực. Các phân tử hữu cơ sẽ được chia thành từng nhóm chất dựa vào nhóm chức chính mà chúng có. Khi phân tách dựa trên độ phân cực, thời gian lưu tương đối của các nhóm chất phần lớn được quyết định bởi bản chất và vị trí của các nhóm chức này. Như ở trên hình P, các hợp chất có thể được sắp xếp theo thời gian lưu tương đối với thứ tự độ phân cực giảm dần.

Hình P. Thứ tự độ phân cực của các nhóm chức

Nước (phân tử nhỏ có moment lưỡng cực lớn) là hợp chất phân cực. Benzene (hydrocarbon thơm) là hợp chất không phân cực. Những phân tử có tính phân cực tương tự nhau sẽ có ái lực với nhau, những chất có tính phân cực khác nhau sẽ có ái lực yếu hơn, thậm chí sẽ đẩy nhau. Đây là nguyên tắc chính về quá trình tách dựa trên độ phân cực.

Hình Q. Sự kết hợp các hiệu ứng của pha tĩnh và pha động lên quá trình phân tách

Để xây dựng hệ thống tách sắc ký (hình Q), chúng ta sẽ tạo sự cạnh tranh các hợp chất có trong mẫu bằng cách chọn pha động và pha tĩnh với độ phân cực khác nhau. Các chất trong mẫu có độ phân cực tương tự pha tĩnh (hạt nhồi cột) sẽ được lưu giữ lâu hơn vì chúng có ái lực lớn hơn với hạt nhồi. Các chất có độ phân cực tương tự pha động sẽ có xu hướng đi cùng pha động và di chuyển nhanh hơn.

Bằng cách này, dựa vào sự sai khác tương đối về lực hút của mỗi chất với mỗi pha, quá trình tách đã được hình thành bằng cách thay đổi tốc độ chất phân tích.

Hình R-1, R-2 và R-3 thể hiện độ phân cực của các dung môi pha động, pha tĩnh và chất phân tích.

Hình R-1: Thứ tự độ phân cực của pha động

Phân tử pha động sẽ cạnh tranh hiệu quả ảnh hưởng lên chất phân tích so với pha tĩnh, khiến chúng di chuyển qua cột nhanh hơn (lưu giữ kém hơn). Nước nằm ở đầu phân cực trên thang đo độ phân cực, trong khi hexane, một hydrocarbon no, nằm ở đầu không phân cực. Ở giữa, các dung môi cũng như các hỗn hợp dung môi tan trong nhau (được trộn theo tỷ lệ phù hợp để đáp ứng nhu cầu sử dụng), sẽ nằm ở giữa trên thang rửa giải. Đầu thang đo thể hiện pha tĩnh mạnh nhất tùy theo bản chất của bề mặt pha tĩnh, nơi xảy ra sự cạnh tranh tương tác với chất phân tích.

Hình R-2: Thứ tự độ phân cực của pha tĩnh

Silica có bề mặt hoạt động, ưa nước, có chứa nhóm chức silanol mang tính acid. Vì vậy, nó nằm ở đầu phân cực trên hình R-2. Độ phân cực của bề mặt silica có thể biến đổi bằng cách gắn thêm các nhóm chức ít phân cực hơn. Ví dụ ở đây, để làm giảm độ phân cực, các nhóm cyanopropylsilyl- (-CN), n-octylsilyl- (C8) và n-octadecylsilyl- (C18, ODS) được gắn lên silica. Các chất ở phía sau là chất nhồi kỵ nước, rất không phân cực.

Hình R-3: Thứ tự độ phân cực của các hợp chất

Hình R-3 thẻ hiện thứ tự độ phân cực của mẫu. Sau khi xem xét độ phân cực của cả hai pha, lựa chọn pha tĩnh phù hợp, nhà phân tích sẽ chọn pha động sao cho chất phân tích sẽ được lưu giữ đủ để hợp chất được rửa giải. Giữa những dung môi cùng độ mạnh, người phân tích sẽ lựa chọn sự kết hợp sao cho có sự sai khác rất nhỏ về độ phân cực và khả năng hòa tan để tối đa hóa độ chọn lọc của hệ thống sắc ký. Tổng quát lại, các nhà phân tích sẽ lựa chọn cặp pha có độ phân cực có tính phân cực ngược nhau, các chất phân tích từ đó sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy theo độ phân cực.

HPLC pha thường

Trong quá trình phân tách của mình, Tswett đã thành công trong việc sử dụng pha tĩnh phân cực (đá phấn trong cột thủy tinh) với dung môi rất kém phân cực hơn (không phân cực) làm pha động. Đây gọi là sắc ký pha thường.

Hình S-1: Sắc ký lỏng pha thường

Hình S-1 thể hiện quá trình tách sắc ký pha thường hỗn hợp ba thuốc nhuộm. Pha tĩnh phân cực và lưu giữ thuốc nhuộm vàng tốt nhất. Thuốc nhuộm xanh tương đối không phân cực chiếm ưu thế trong sự cạnh tranh gây ra bởi pha động, dung môi không phân cực và được rửa giải nhanh chóng vì thuốc nhuộm xanh có chung tính chất phân cực. Pha tĩnh thường dùng trong sắc ký pha thường là silica với pha động là dung môi hữu cơ 100%, không sử dụng nước.

HPLC pha đảo

Khái niệm pha đảo để mô tả kiểu sắc ký ngược với pha thường, với pha động phân cực và pha tĩnh không phân cực (kị nước). Hình S-2 thể hiện quá trình phân tách hỗn hợp thuốc nhuộm với kiểu sắc ký này.

Hình S-2: Sắc ký lỏng pha đảo

Bây giờ chất bị lưu giữ nhất là thuốc nhuộm xanh kém phân cực, vì nó có ái lực lớn nhất với pha tĩnh. Thuốc nhuộm vàng phân cực có ái lực nhỏ nhất, chiếm ưu thế trong tương tác với pha động ưa nước, di chuyển nhanh nhất và bị rửa giải sớm nhất.

Ngày nay, vì tính lặp lại và khả năng ứng dụng rộng rãi của mình, sắc ký pha đảo chiếm đến 75% các phương pháp phân tích bằng HPLC. Các phương pháp này thường sử dụng pha động là hỗn hợp của nước với dung môi hữu cơ phân cực, dễ tan trong nước, ví dụ như acetonitrile hay methanol. Điều này đảm bảo tương tác của chất phân tích với hạt nhồi không phân cực, kị nước. Silica gắn C18 (ODS) là loại hạt nhồi thường dùng nhất trong HPLC pha đảo.

Bảng C: Tính chất các pha trong quá trình phân tách dựa trên độ phân cực

Sắc ký tương tác ưa nước (HILIC)

HILIC có thể được xem như một biến thể của sắc ký lỏng pha thường. Trong sắc ký lỏng pha thường, pha động là 100% hữu cơ. Chỉ có lượng vết của nước là có trong pha động và trong các lỗ xốp của hạt nhồi. Chất phân tích gắn chặt vào pha tĩnh phân cực và có thể không được rửa giải.

Bằng việc thêm nước (< 20%) vào pha động chứa dung môi hữu cơ (thường là dung môi không chứa hydro hoạt động như acetonitrile) giúp chúng có khả năng tách và rửa giải các hợp chất phân cực bị lưu giữ mạnh khi sử dụng sắc ký lỏng pha thường). Nước, một dung môi rất phân cực, cạnh tranh hiệu quả với chất phân tích phân cực về tương tác với pha tĩnh. HILIC có thể chạy được cả đẳng dòng cũng như gradient. Những hợp chất phân cực có xu hướng bị hút vào hạt nhồi phân cực có thể được rửa giải vì độ phân cực đã tăng lên (bằng cách cho thêm nước). Các chất phân tích được rửa giải theo thứ tự tăng dần tính ưa nước. Dung dịch đệm hoặc muối được thêm vào pha động để giữ các chất có khả năng ion hóa ở dạng ban đầu.

Sắc ký tương tác kị nước (HIC)

HIC là kiểu sắc ký pha đảo dùng để tách các đại phân tử sinh học, ví dụ như protein. Nó thường được sử dụng để giữ các phân tử này nguyên vẹn trong dung dịch có chứa nước, ngăn không cho tiếp xúc với các dung môi hữu cơ hay bề mặt có thể làm biến tính chúng. HIC sử dụng tương tác kị nước của các đại phân tử với pha tĩnh tương đối kị nước, ví dụ như silica gắn nhóm butyl (C4) hơn là silica gắn C18. Ban đầu, nồng độ muối trong nước cao sẽ giúp muối tồn tại trong cột. Quá trình phân tách sử dụng gradient thường sẽ làm giảm nồng độ muối. Bằng cách này, các phân tử sinh học được rửa giải theo thứ tự tăng dần tính kị nước.

Phân tách dựa trên điện tích: Sắc ký trao đổi ion (IEC)

Trong sắc ký trao đổi ion, các điện tích trái dấu hút nhau, các điện tích cùng dấu đẩy nhau. Pha tĩnh trong phân tách trao đổi ion được quyết định bởi bản chất và tính acid hoặc base của nhóm chức gắn trên bề mặt cùng với loại ion mà nó hút và lưu giữ. Vật liệu trao đổi cation được sử dụng để lưu giữ và tách các chất tích điện dương trên bề mặt tích điện âm và ngược lại, vật liệu trao đổi anion được sử dụng để lưu giữ và tách các chất tích điện âm trên bề mặt tích điện dương. Với từng loại trao đổi ion, có hai hướng tiếp cận chính cho quá trình tách và rửa giải.

Hình T: Sắc ký trao đổi ion

Chất trao đổi ion mạnh có mang những nhóm chức (VD: amine bậc 4 hay acid sulfonic) sẽ luôn luôn được ion hóa. Nó thường được sử dụng để lưu giữ và phân tách các ion yếu. Các ion yếu này sẽ được cách rửa giải bằng cách di chuyển cùng pha động chứa ion bị hút mạnh hơn với pha tĩnh. Xen vào giữa, các ion yếu có thể sẽ bị lưu giữ trên cột, sau đó được trung hòa bằng cách thay đổi pH pha động ngay trên cột, khiến chúng không còn bị hút và được rửa giải khỏi cột.

Chất trao đổi ion yếu (VD: amine bậc 2 hay nhóm chức acid carboxylic) có thể được trung hòa ở pH trên hoặc dưới pH làm mất khả năng lưu giữ ion bằng điện tích. Khi được tích điện, nó được dùng để lưu giữ và phân tách các ion mạnh. Nếu những ion này không bị rửa giải bởi dòng pha động, các vị trí trao đổi ion của pha tĩnh sẽ được trung hòa, lấp các điểm hút ion, cho phép rửa giải chất phân tích.

Bảng D: Quy luật trao đổi ion

Khi các chất trao đổi ion yếu bị trung hòa, nó có thể lưu giữ và tách các chất dựa trên tương tác kị nước (pha đảo) hay ưa nước (pha thường); trong trường hợp này,  mức độ rửa giải được quyết định bởi độ phân cực của pha động (hình R-1). Vì vậy, các chất trao đổi ion yếu có thể được sử dụng để phân tách theo chế độ hỗn hợp (dựa trên cả độ phân cực và điện tích).

Bảng D thể hiện một số kiểu trao đổi ion chính. Ví dụ, để lưu giữ chất phân tích có tính base mạnh (luôn tích điện dương), pha tĩnh trao đổi cation yếu được sử dụng ở pH > 7; điều này đảm bảo bề mặt luôn tích điện âm. Để rửa giải các base mạnh, pH pha động được đưa về pH < 3; điều này giúp loại bỏ điện tích trên bề mặt và khử cơ chế lưu giữ bằng trao đổi ion.

pKa là giá trị pH mà ở đó 50% số nhóm chức bị ion hóa, 50% là ở dạng trung hòa. Để đảm bảo tính trung hòa hoặc tích điện hoàn toàn, chất phân tích hoặc bề mặt hạt nhồi, pH phải nằm ngoài khoảng pKa ±.

Không được dùng chất trao đổi cation mạnh để lưu giữ base mạnh; cả hai sẽ cùng mang điện và bị hút chặt vào nhau, không thể rửa giải được. Điều này chỉ có thể loại bỏ bằng cách ngâm chất trao đổi ion mạnh với một base có khả năng lưu giữ mạnh hơn và chiếm chỗ của chất phân tích do thắng trong sự cạnh tranh tại các vị trí trao đổi ion. Hướng tiếp cận này hiếm khi sử dụng kèm HPLC hay SPE vì rất nguy hiểm, do acid và base cực mạnh có tính ăn mòn cao với các vật liệu sử dụng cho HPLC.

Phân tách dựa trên kích thước: Sắc ký loại cỡ (SEC) – Sắc ký thẩm gel (GPC)

Vào những năm 1950, Porath và Flodin đã phát hiện ra rằng, các phân tử sinh học có thể được tách dựa trên kích thước hơn là dựa trên độ phân cực bằng cách cho đi qua một vật liệu xốp, polymer dextran ưa nước. Quá trình này được gọi là lọc gel. Một quá trình tương tự được sử dụng để phân tách oligomer tổng hợp và polymer sử dụng hạt nhồi là polymer hữu cơ tổng hợp có nhiều kích thước lỗ xốp khác nhau. Quá trình này gọi là sắc ký thẩm gel (GPC). Quá trình tương tự sử dụng hạt nhồi silica gọi là sắc ký loại cỡ (SEC). Hệ thống HPLC thương mại ứng dụng GPC được ra mắt lần đầu năm 1963.

Các kỹ thuật trên thường được thực hiện trên pha tĩnh được tổng hợp sao cho kích thước lỗ xốp thay đổi  trong khoảng cho phép chất phân tích đi vào, và được phân loại theo kích thước. Phân tử nhỏ sẽ chui vào các lỗ xốp trong khi các phân tử lớn sẽ chỉ di chuyển giữa các hạt, được rửa giải nhanh chóng. Pha động phải đạt hai điều kiện: hòa tan tốt các chất phân tích và ngăn các tương tác giữa chất phân tích và bề mặt pha tĩnh. Trong trường hợp này, phân tử lớn bị rửa giải trước, phân tử nhỏ bị rửa giải sau (vì chúng di chuyển ra vào các lỗ xốp).

Vì nó có thể lập mối tương quan giữa khối lượng polymer và kích thước trong dung dịch, GPC đã cải tiến quá trình đo sự phân bố khối lượng của polymer, từ đó xác định được tính chất vật lý của polymer.